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香蕉苗組培培養(yǎng)的過程
來源： 類別：技術(shù)文章 更新時間：2013-01-11 閱讀次
香蕉是我國南方四大佳果之一。其為草本果樹，速生快長，投產(chǎn)年限短，產(chǎn)量高，經(jīng)濟效益好，深受各香蕉生產(chǎn)國及蕉農(nóng)的重視。香蕉組織快繁與傳統(tǒng)吸芽繁殖相比，具有無病毒、變異率小、生長一致、果實商品性好、種苗便于運輸?shù)葍?yōu)點，自推廣以來，需求日益增大，生產(chǎn)香蕉組培苗的廠家也與日俱增。而在香蕉工廠化育苗過程中，由于變異的發(fā)生、污染嚴重等問題，致使其成本增高，商品率降低，制約了香蕉規(guī)模化生產(chǎn)的發(fā)展。
為了向蕉農(nóng)提供優(yōu)質(zhì)、價廉的種苗，云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所組培中心經(jīng)過近10年的研究實踐，針對香蕉工廠化育苗中常見的一些問題，改進技術(shù)，不斷的嘗試和探索，在提高生產(chǎn)技術(shù)、降低生產(chǎn)成本、優(yōu)化生產(chǎn)流程方面進行研究，建成了一套培育優(yōu)質(zhì)、高效、低耗快速繁育香蕉苗的技術(shù)體系，旨在推動優(yōu)質(zhì)香蕉種苗的生產(chǎn)及其產(chǎn)業(yè)化進程。
1 香蕉組培苗的生產(chǎn)流程
1.1 培養(yǎng)基的配方
根據(jù)云南省農(nóng)科院糧食作物研究所組織培養(yǎng)中心多年生產(chǎn)香蕉組培苗的試驗結(jié)果，篩選出3組培養(yǎng)階段必需培養(yǎng)基：誘導(dǎo)分生組織培養(yǎng)基：MS+BA 3.5~4.5 mg/L+NAA 0.1~0.2 mg/L;增殖培養(yǎng)基：MS+BA 2~3 mg/L+NAA 0.05~0.15 mg/L;生根培養(yǎng)基：1/2MS+NAA 0.1~0.2 mg/L+活性碳0.5%。
1.2 培養(yǎng)條件
以上培養(yǎng)基均加入2%~3%的食用白糖，6%~7%的瓊脂，滅菌前pH值調(diào)至5.5~5.8,培養(yǎng)基配好后，充分攪拌，定量分裝入潔凈的玻璃瓶中封口，于1.1kg/cm²壓力和121e下滅菌20 min,冷卻后備用。香蕉組培苗最適宜生長的溫度是25~28℃，可根據(jù)生產(chǎn)需要進行必要的調(diào)節(jié)，不能低于14℃，不能高于32℃。培養(yǎng)初期，需弱光誘導(dǎo)不定芽的生產(chǎn)；培養(yǎng)后期，將組培培養(yǎng)室的光照調(diào)至2 000~3 000 lx,光照時間為12 h/d。
1.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)
起始培養(yǎng)的目的是獲得無菌苗，建立無菌繁殖體系。晴天，在無傳統(tǒng)病害的香蕉區(qū)，選用長勢健壯、掛果整齊、產(chǎn)量高的母株，挖取其剛露出地面的完整吸芽，洗去外表泥土，剝除芽外面的葉鞘及不定根，先用洗衣粉水洗滌，再用自來水沖洗干凈，最后用刀將吸芽修成（4~5） cm×（6~7）cm（直徑×高）大小。帶入接種室，用酒精棉球擦拭后，在超菌工作臺上，層層剝?nèi)ゼ偾o葉鞘，修剪成約3 cm×3.5 cm（直徑@高）大小帶生長點的吸芽，用75%酒精浸泡1 min,無菌水沖洗1次，再用0.1%的升汞溶液消毒殺菌15 min,并不斷搖動處理液，然后用無菌水沖洗4~5次，以莖尖為中心縱切成2~4塊，接入培養(yǎng)基，每瓶接種1塊，置于培養(yǎng)室中，培養(yǎng)35~50 d后，可長出新芽。
1.4 繼代培養(yǎng)
把上述獲得新芽轉(zhuǎn)接在培養(yǎng)基上，弱光條件下培養(yǎng)。如條件適宜，20~30 d即可繼代1次。不定芽通過不斷轉(zhuǎn)接、分割，使芽的數(shù)量不斷增加，達到增殖目的。
1.5 壯苗與生根
當(dāng)芽增殖到預(yù)定數(shù)量后，在保持一定的基數(shù)條件下，小于2.5 cm的不定芽轉(zhuǎn)接在培養(yǎng)基上繼續(xù)增殖培養(yǎng)，高于2.5 cm的不定芽單個切開，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，在光照條件下培養(yǎng)。約14 d后，便開始長根，當(dāng)小植株長有2片以上的綠葉；25~35 d后，苗高約4 cm時，即可出瓶練苗。
2 生產(chǎn)中常見的問題及解決措施
2.1 變異
香蕉組培苗在繼代培養(yǎng)過程中，容易發(fā)生遺傳變異，其變異率通常比吸芽苗高，異常芽形態(tài)多樣（如芽細小、矮化、白色、扁平、基部褐色或呈圓球狀，葉鞘散開或肥大等）。隨著培養(yǎng)代數(shù)的增高，變異率逐漸增大[5],因此，繼代培養(yǎng)的代數(shù)一般不能超過10代。在起始培養(yǎng)階段，一定要選好取芽的季節(jié)、天氣及外植體材料，并滿足較好的培養(yǎng)條件；在整個生產(chǎn)過程中，激素的種類都不宜用得過多，繁殖階段以單純使用6OBA+低濃度NAA效果最好，生根階段以單純使用NAA或IBA效果最好，激素濃度盡量遵照/能低就絕不用高0的原則；蔗糖濃度2%~3%,培育后期以2%為宜；在接種過程中，及時剔除變異苗，變異率控制在5%以內(nèi)。盡可能的減少對材料的機械損傷及灼傷。
2.2 污染
污染是植物組織培養(yǎng)中普遍存在的問題，也是影響香蕉試管苗生產(chǎn)成本最重要的因素之一，它在很大程度上決定著試管苗的生產(chǎn)和經(jīng)濟效益。理論上做過統(tǒng)計，污染率每上升5%,生產(chǎn)成本將遞增10%以上，污染率越高，再此基礎(chǔ)上的遞增率越大，更易造成交叉感染，嚴重時，使整個生產(chǎn)流程都難以正常運轉(zhuǎn)。因此，必須采取有利措施，最大限度的降低污染率。主要做好以下幾方面的工作來減少污染源：接種室、緩沖間、培養(yǎng)室及培養(yǎng)基貯藏室每2個月至少要用甲醛和高錳酸鉀（5~10）B1熏蒸1次，定期用新吉爾滅菌水溶液拖地板及門、窗、培養(yǎng)架等設(shè)備，雨季還應(yīng)經(jīng)常啟動空調(diào)機的干燥功能降低空氣濕度；嚴格要求接種制度，所用的各種接種工具需經(jīng)常消毒殺菌，所有接種人員需技術(shù)培訓(xùn)后上崗，接種時都應(yīng)穿戴消毒過的衣服和帽子；管理人員要經(jīng)常檢查、監(jiān)督和糾正不規(guī)范操作，強化接種人員的“無菌操作”概念，改進接種方法；基芽轉(zhuǎn)接培養(yǎng)前，必須認真挑選，確定是無菌苗后，才可以進一步繼代培養(yǎng)，帶菌輕的細菌性污染苗可繼續(xù)留用，作為生根苗培養(yǎng)。
2.3 褐變
香蕉材料體內(nèi)含有單寧等物質(zhì)，在培養(yǎng)初期，由于被切割時溢泌出的一些酚類物質(zhì)接觸到空氣中的氧氣，組織中的多酚氧化酶被激活，香蕉材料自動氧化或由酚類催化氧化為相應(yīng)的醌類，擴散到培養(yǎng)基中，呈現(xiàn)棕褐色，這些物質(zhì)會抑制其它酶的活性，毒害培養(yǎng)物，影響不定芽的增殖效果，嚴重時，使培養(yǎng)的材料生長停頓，失去分化能力，最終變褐死亡。生產(chǎn)上可根據(jù)不同的實際情況，選擇不同的方法減少褐變。主要有如下措施：選用抗酚類氧化藥劑（常見的有半胱氨酸、抗壞血酸、二硫蘇糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、二乙基二硫氨基甲酸脂等），配制成適當(dāng)?shù)臐舛龋^濾滅菌后洗滌剛切割的外植體傷口表面；選擇最佳培養(yǎng)條件，適當(dāng)降低培養(yǎng)基中的無機鹽、糖和激素的濃度，加入適量活性炭（0.5~2.0 mg/L），降低培養(yǎng)室的溫度；采取連續(xù)轉(zhuǎn)接的方法，及時轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基上；接種時，嚴格選擇外植體的部位，且動作迅速，避免外植體在空氣中暴露的時間過長，盡可能的減少對外植體的機械損傷。
3 討論
香蕉組培苗的生產(chǎn)成本主要由材料費、水電費和勞務(wù)費3個部分組成，其中材料費、水電費大約各占30%,勞務(wù)費約占40%。為了降低無毒種苗的生產(chǎn)成本，針對香蕉的生產(chǎn)特點和問題，經(jīng)過多年的探索，對生產(chǎn)流程中的2個關(guān)鍵環(huán)節(jié)進行了改進。
3.1 優(yōu)化培養(yǎng)基配方
適宜的培養(yǎng)基配方有利于提高香蕉種苗質(zhì)量并降低生產(chǎn)成本。在培養(yǎng)基配制過程中，以自來水代替蒸餾水，以白糖代替蔗糖，以農(nóng)用型6OBA代替化學(xué)試劑6OBA。對MS培養(yǎng)基作了一些改良，除去原培養(yǎng)基中肌醇，降低MS中的微量元素至原用量的1/2,生根階段降低糖的用量至3%,增殖階段，瓊脂的用量可降至5%,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不會對組培苗的質(zhì)量有顯著影響。
3.2 提高技術(shù)及管理水平
影響香蕉組培苗的工廠化生產(chǎn)質(zhì)量和生產(chǎn)效益的因素很多，也很復(fù)雜。但技術(shù)是基礎(chǔ)，管理是關(guān)鍵。
必須不斷完善生產(chǎn)設(shè)施，提供最佳的溫、光控制條件，減少生產(chǎn)車間的病菌種類及數(shù)量；加強科研技術(shù)，不斷進行技術(shù)創(chuàng)新，提高技術(shù)水平；同時進行科學(xué)的管理，通過經(jīng)濟效益與生產(chǎn)過程掛鉤，提高工作積極性，進行勞動力資源的優(yōu)化分配。目前對培養(yǎng)基配方的研究較多，而在其綜合管理方面的研究卻很少，還需進一步的加強，只有技術(shù)與管理都不斷的改進和提高，相互協(xié)調(diào)，才能優(yōu)化其生產(chǎn)流程、降低其生產(chǎn)成本，不斷提高工廠化快速繁殖優(yōu)質(zhì)香蕉種苗的經(jīng)濟效益。
為了向蕉農(nóng)提供優(yōu)質(zhì)、價廉的種苗，云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所組培中心經(jīng)過近10年的研究實踐，針對香蕉工廠化育苗中常見的一些問題，改進技術(shù)，不斷的嘗試和探索，在提高生產(chǎn)技術(shù)、降低生產(chǎn)成本、優(yōu)化生產(chǎn)流程方面進行研究，建成了一套培育優(yōu)質(zhì)、高效、低耗快速繁育香蕉苗的技術(shù)體系，旨在推動優(yōu)質(zhì)香蕉種苗的生產(chǎn)及其產(chǎn)業(yè)化進程。
1 香蕉組培苗的生產(chǎn)流程
1.1 培養(yǎng)基的配方
根據(jù)云南省農(nóng)科院糧食作物研究所組織培養(yǎng)中心多年生產(chǎn)香蕉組培苗的試驗結(jié)果，篩選出3組培養(yǎng)階段必需培養(yǎng)基：誘導(dǎo)分生組織培養(yǎng)基：MS+BA 3.5~4.5 mg/L+NAA 0.1~0.2 mg/L;增殖培養(yǎng)基：MS+BA 2~3 mg/L+NAA 0.05~0.15 mg/L;生根培養(yǎng)基：1/2MS+NAA 0.1~0.2 mg/L+活性碳0.5%。
1.2 培養(yǎng)條件
以上培養(yǎng)基均加入2%~3%的食用白糖，6%~7%的瓊脂，滅菌前pH值調(diào)至5.5~5.8,培養(yǎng)基配好后，充分攪拌，定量分裝入潔凈的玻璃瓶中封口，于1.1kg/cm²壓力和121e下滅菌20 min,冷卻后備用。香蕉組培苗最適宜生長的溫度是25~28℃，可根據(jù)生產(chǎn)需要進行必要的調(diào)節(jié)，不能低于14℃，不能高于32℃。培養(yǎng)初期，需弱光誘導(dǎo)不定芽的生產(chǎn)；培養(yǎng)后期，將組培培養(yǎng)室的光照調(diào)至2 000~3 000 lx,光照時間為12 h/d。
1.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)
起始培養(yǎng)的目的是獲得無菌苗，建立無菌繁殖體系。晴天，在無傳統(tǒng)病害的香蕉區(qū)，選用長勢健壯、掛果整齊、產(chǎn)量高的母株，挖取其剛露出地面的完整吸芽，洗去外表泥土，剝除芽外面的葉鞘及不定根，先用洗衣粉水洗滌，再用自來水沖洗干凈，最后用刀將吸芽修成（4~5） cm×（6~7）cm（直徑×高）大小。帶入接種室，用酒精棉球擦拭后，在超菌工作臺上，層層剝?nèi)ゼ偾o葉鞘，修剪成約3 cm×3.5 cm（直徑@高）大小帶生長點的吸芽，用75%酒精浸泡1 min,無菌水沖洗1次，再用0.1%的升汞溶液消毒殺菌15 min,并不斷搖動處理液，然后用無菌水沖洗4~5次，以莖尖為中心縱切成2~4塊，接入培養(yǎng)基，每瓶接種1塊，置于培養(yǎng)室中，培養(yǎng)35~50 d后，可長出新芽。
1.4 繼代培養(yǎng)
把上述獲得新芽轉(zhuǎn)接在培養(yǎng)基上，弱光條件下培養(yǎng)。如條件適宜，20~30 d即可繼代1次。不定芽通過不斷轉(zhuǎn)接、分割，使芽的數(shù)量不斷增加，達到增殖目的。
1.5 壯苗與生根
當(dāng)芽增殖到預(yù)定數(shù)量后，在保持一定的基數(shù)條件下，小于2.5 cm的不定芽轉(zhuǎn)接在培養(yǎng)基上繼續(xù)增殖培養(yǎng)，高于2.5 cm的不定芽單個切開，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，在光照條件下培養(yǎng)。約14 d后，便開始長根，當(dāng)小植株長有2片以上的綠葉；25~35 d后，苗高約4 cm時，即可出瓶練苗。
2 生產(chǎn)中常見的問題及解決措施
2.1 變異
香蕉組培苗在繼代培養(yǎng)過程中，容易發(fā)生遺傳變異，其變異率通常比吸芽苗高，異常芽形態(tài)多樣（如芽細小、矮化、白色、扁平、基部褐色或呈圓球狀，葉鞘散開或肥大等）。隨著培養(yǎng)代數(shù)的增高，變異率逐漸增大[5],因此，繼代培養(yǎng)的代數(shù)一般不能超過10代。在起始培養(yǎng)階段，一定要選好取芽的季節(jié)、天氣及外植體材料，并滿足較好的培養(yǎng)條件；在整個生產(chǎn)過程中，激素的種類都不宜用得過多，繁殖階段以單純使用6OBA+低濃度NAA效果最好，生根階段以單純使用NAA或IBA效果最好，激素濃度盡量遵照/能低就絕不用高0的原則；蔗糖濃度2%~3%,培育后期以2%為宜；在接種過程中，及時剔除變異苗，變異率控制在5%以內(nèi)。盡可能的減少對材料的機械損傷及灼傷。
2.2 污染
污染是植物組織培養(yǎng)中普遍存在的問題，也是影響香蕉試管苗生產(chǎn)成本最重要的因素之一，它在很大程度上決定著試管苗的生產(chǎn)和經(jīng)濟效益。理論上做過統(tǒng)計，污染率每上升5%,生產(chǎn)成本將遞增10%以上，污染率越高，再此基礎(chǔ)上的遞增率越大，更易造成交叉感染，嚴重時，使整個生產(chǎn)流程都難以正常運轉(zhuǎn)。因此，必須采取有利措施，最大限度的降低污染率。主要做好以下幾方面的工作來減少污染源：接種室、緩沖間、培養(yǎng)室及培養(yǎng)基貯藏室每2個月至少要用甲醛和高錳酸鉀（5~10）B1熏蒸1次，定期用新吉爾滅菌水溶液拖地板及門、窗、培養(yǎng)架等設(shè)備，雨季還應(yīng)經(jīng)常啟動空調(diào)機的干燥功能降低空氣濕度；嚴格要求接種制度，所用的各種接種工具需經(jīng)常消毒殺菌，所有接種人員需技術(shù)培訓(xùn)后上崗，接種時都應(yīng)穿戴消毒過的衣服和帽子；管理人員要經(jīng)常檢查、監(jiān)督和糾正不規(guī)范操作，強化接種人員的“無菌操作”概念，改進接種方法；基芽轉(zhuǎn)接培養(yǎng)前，必須認真挑選，確定是無菌苗后，才可以進一步繼代培養(yǎng)，帶菌輕的細菌性污染苗可繼續(xù)留用，作為生根苗培養(yǎng)。
2.3 褐變
香蕉材料體內(nèi)含有單寧等物質(zhì)，在培養(yǎng)初期，由于被切割時溢泌出的一些酚類物質(zhì)接觸到空氣中的氧氣，組織中的多酚氧化酶被激活，香蕉材料自動氧化或由酚類催化氧化為相應(yīng)的醌類，擴散到培養(yǎng)基中，呈現(xiàn)棕褐色，這些物質(zhì)會抑制其它酶的活性，毒害培養(yǎng)物，影響不定芽的增殖效果，嚴重時，使培養(yǎng)的材料生長停頓，失去分化能力，最終變褐死亡。生產(chǎn)上可根據(jù)不同的實際情況，選擇不同的方法減少褐變。主要有如下措施：選用抗酚類氧化藥劑（常見的有半胱氨酸、抗壞血酸、二硫蘇糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、二乙基二硫氨基甲酸脂等），配制成適當(dāng)?shù)臐舛龋^濾滅菌后洗滌剛切割的外植體傷口表面；選擇最佳培養(yǎng)條件，適當(dāng)降低培養(yǎng)基中的無機鹽、糖和激素的濃度，加入適量活性炭（0.5~2.0 mg/L），降低培養(yǎng)室的溫度；采取連續(xù)轉(zhuǎn)接的方法，及時轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基上；接種時，嚴格選擇外植體的部位，且動作迅速，避免外植體在空氣中暴露的時間過長，盡可能的減少對外植體的機械損傷。
3 討論
香蕉組培苗的生產(chǎn)成本主要由材料費、水電費和勞務(wù)費3個部分組成，其中材料費、水電費大約各占30%,勞務(wù)費約占40%。為了降低無毒種苗的生產(chǎn)成本，針對香蕉的生產(chǎn)特點和問題，經(jīng)過多年的探索，對生產(chǎn)流程中的2個關(guān)鍵環(huán)節(jié)進行了改進。
3.1 優(yōu)化培養(yǎng)基配方
適宜的培養(yǎng)基配方有利于提高香蕉種苗質(zhì)量并降低生產(chǎn)成本。在培養(yǎng)基配制過程中，以自來水代替蒸餾水，以白糖代替蔗糖，以農(nóng)用型6OBA代替化學(xué)試劑6OBA。對MS培養(yǎng)基作了一些改良，除去原培養(yǎng)基中肌醇，降低MS中的微量元素至原用量的1/2,生根階段降低糖的用量至3%,增殖階段，瓊脂的用量可降至5%,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不會對組培苗的質(zhì)量有顯著影響。
3.2 提高技術(shù)及管理水平
影響香蕉組培苗的工廠化生產(chǎn)質(zhì)量和生產(chǎn)效益的因素很多，也很復(fù)雜。但技術(shù)是基礎(chǔ)，管理是關(guān)鍵。
必須不斷完善生產(chǎn)設(shè)施，提供最佳的溫、光控制條件，減少生產(chǎn)車間的病菌種類及數(shù)量；加強科研技術(shù)，不斷進行技術(shù)創(chuàng)新，提高技術(shù)水平；同時進行科學(xué)的管理，通過經(jīng)濟效益與生產(chǎn)過程掛鉤，提高工作積極性，進行勞動力資源的優(yōu)化分配。目前對培養(yǎng)基配方的研究較多，而在其綜合管理方面的研究卻很少，還需進一步的加強，只有技術(shù)與管理都不斷的改進和提高，相互協(xié)調(diào)，才能優(yōu)化其生產(chǎn)流程、降低其生產(chǎn)成本，不斷提高工廠化快速繁殖優(yōu)質(zhì)香蕉種苗的經(jīng)濟效益。
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